研究內容

操(cao)作過程

一(yi)般技(ji)術要點說(shuo)明

方法摸索優(you)化

目標優化梯度條件，確定(ding)分析波長。

1、 樣品溶劑選擇(ze)；

2、 濾膜吸附(fu)試驗；

3、 DAD檢測器下，波長選擇(ze)主(zhu)成分最大(da)吸收(shou)或平(ping)臺處。

4、 分離條件選擇(ze)；

5、 色譜柱對(dui)比；（根(gen)據情況酌定）

6、DAD檢(jian)測(ce)器下，水、1mol/l酸(suan)、堿、氧（10%雙氧水）、光照(zhao)、高溫破壞(huai)，各起(qi)始物料，中間(jian)體，輔料（制劑研(yan)究(jiu)時需同時進行(xing)空(kong)白輔料破壞(huai)）等成分分離。

1、 一般在無參考標(biao)準(zhun)或標(biao)準(zhun)的方法無法直接套(tao)用時,需進(jin)行(xing)此項研究(jiu)內容，如3類藥。

2、樣品溶劑：對樣品有很(hen)好的溶解能力，實驗室(shi)自然(ran)放(fang)(fang)置穩定(ding)存放(fang)(fang)12小時以上，與流動相(xiang)有良(liang)好的互溶效(xiao)果(guo)。

3、續濾液峰面積達穩定最大(da)值，續濾液體積在(zai)5ml以下時較(jiao)為適宜，否則(ze)需要重新(xin)篩選溶(rong)劑(ji)。

4、破壞(huai)程度10%左右（5%—15%）為(wei)宜，2mol/l酸或(huo)堿90℃水浴(yu)12小(xiao)時(shi)無破壞(huai)即(ji)視為(wei)樣(yang)品(pin)穩定，不(bu)必再追(zhui)求降解度。4500lx光照48小(xiao)時(shi)，樣(yang)品(pin)粉末及(ji)溶液需(xu)要同時(shi)做。破壞(huai)后的樣(yang)品(pin)溶液及(ji)空白(bai)溶劑均需(xu)調整至流(liu)動相pH方可進樣(yang)，可避免對色譜柱(zhu)產生不(bu)良影(ying)響(xiang)。如(ru)果破壞(huai)超(chao)過20%，需(xu)要降低破壞(huai)條件(jian)。

5、分(fen)離度良好(hao)，測定無干擾，各峰峰純度符合單峰要求。

6、梯度變化要有(you)最高洗(xi)脫(tuo)能力過程，目的證明(ming)所有(you)的雜質成分均能夠被洗(xi)脫(tuo)檢測。

7、方法摸索優化實驗(yan)一般是(shi)不上資(zi)料的，只是(shi)體現(xian)在(zai)實驗(yan)記錄本中(zhong)，除非是(shi)沒有(you)方法依據時，如3類藥申報時，梯度選(xuan)擇(ze)及波長選(xuan)擇(ze)等(deng)均需要在(zai)資(zi)料中(zhong)體現(xian)。

8、方(fang)法優(you)化(hua)完成后，最后在同一天(tian)同一人，用同一臺機器，對所有樣品進行分析測定，具有可比性。

9、方法摸索優化實(shi)驗采(cai)用(yong)工藝已(yi)經確定的實(shi)驗室小試、實(shi)驗室放大樣品(pin)進行，前期用(yong)于(yu)原料合成樣品(pin)配合檢測(ce)時，可以(yi)采(cai)用(yong)大范圍的梯度洗(xi)脫進行模糊檢測(ce)分(fen)析。

專屬性(xing)

目的為了(le)驗證方(fang)法(fa)對目標成分(fen)(fen)檢(jian)測的區分(fen)(fen)能力(li)及全面的雜質分(fen)(fen)析評價。

DAD檢(jian)測(ce)器(qi)或適宜(yi)的通用型檢(jian)測(ce)器(qi)下，水、1mol/l酸、堿、氧（10%雙氧水）、光照(zhao)(zhao)、高(gao)溫破壞，各起(qi)始(shi)物料(liao)，中(zhong)間體，輔料(liao)，各雜質(zhi)對照(zhao)(zhao)品等在同一天進行分析，可(ke)以作為(wei)申報(bao)資料(liao)中(zhong)雜質(zhi)譜(pu)的論(lun)述內容。

1、參照上述過程進行破壞樣品制(zhi)備，空白(bai)及陰性樣品都要做。

2、分(fen)離(li)度良好，測(ce)定無干(gan)擾，各峰峰純(chun)度符合單峰要求。

3、梯度要有最高洗脫能(neng)力過程(cheng)。

4、以前期確定的分析條件及方法，在同(tong)(tong)一(yi)天(tian)同(tong)(tong)一(yi)人，用同(tong)(tong)一(yi)臺機器，對所有樣品進行分析測定，具有可(ke)比性。

5、本部分數據進(jin)資料，最佳采用生產線驗證的第(di)1批樣品進(jin)行。

當(dang)色譜(pu)條件(jian)與有關物質檢查方(fang)法(fa)相同時(shi)，專屬性實(shi)驗數據可以共(gong)用。

出圖時主成分峰的紫外光(guang)譜圖及(ji)峰純度圖均要出圖。

檢測限

信(xin)噪比(bi)法，S/N≥3倍(bei)時的濃度為檢測限。

先(xian)進空白，再進對(dui)照品濃溶(rong)液(ye)(ye)(ye)（1mg/ml），在(zai)主峰相同位(wei)置(zhi)處選擇空白溶(rong)劑(ji)1—2min范圍(wei)的基線(xian)積分(fen)得出峰高，按照峰高的3倍計算樣品濃度，直接用濃溶(rong)液(ye)(ye)(ye)稀釋(shi)至目標濃度附(fu)近即可，資料中(zhong)體現至少3張圖（空白溶(rong)劑(ji)、濃溶(rong)液(ye)(ye)(ye)、及(ji)稀釋(shi)液(ye)(ye)(ye)）。

定量限

信噪比法，S/N≥10倍(bei)時的濃(nong)度為定量限。

按照(zhao)基線峰(feng)高的10倍計(ji)算(suan)樣(yang)品濃(nong)(nong)度(du)(du)，直(zhi)接(jie)用(yong)檢(jian)(jian)測(ce)限(xian)濃(nong)(nong)溶液稀釋至目(mu)標濃(nong)(nong)度(du)(du)附近即(ji)可(ke)，連續進樣(yang)6針，計(ji)算(suan)峰(feng)面積RSD<2%（可(ke)以放(fang)寬至5%），資(zi)料中體現(xian)6張圖（6張稀釋液）。與檢(jian)(jian)測(ce)限(xian)在同一天做，出(chu)圖時(shi)縱軸標尺(chi)與檢(jian)(jian)測(ce)限(xian)一致，減少審評員審圖時(shi)的信息誤導，提高審圖效率。

線性與范圍

5點或7點法(fa)，酌情設置。

第一個(ge)點(dian)在定量(liang)(liang)限濃(nong)度，中間點(dian)為100%濃(nong)度，最(zui)后一個(ge)點(dian)為200%濃(nong)度（160%或(huo)180%），必(bi)須采用(yong)稀釋法，不(bu)得采用(yong)調整進樣量(liang)(liang)的方式。r>0.999。

采用對照品進行。

線性(xing)范圍(wei)(wei)一定要(yao)將回收(shou)率試驗的最高濃(nong)度包含進去，否(fou)則回收(shou)率濃(nong)度超過線性(xing)范圍(wei)(wei)，缺乏定量依據，這個錯(cuo)誤非常常見。

精密度

同一份供試品（樣品）溶液，連續進6次。

 計算峰面(mian)積RSD<2%，資(zi)料中(zhong)體(ti)現7張圖（1張空白，6張樣品液）。

進資料的(de)圖譜(pu)必須(xu)采(cai)用生(sheng)產線(xian)驗證的(de)第1批樣品進行。

溶(rong)液(ye)穩定(ding)性

與精密度在(zai)同一(yi)天穿插進行，實驗前進行良(liang)好的排序設置，能(neng)共用(yong)的圖盡量共用(yong)減少(shao)工作(zuo)量。以下時間點(dian)必做（除非已(yi)知穩定(ding)性情(qing)況可(ke)減少(shao)時間點(dian)）。

0、4、6、8、10、12、18、24。

實驗過程中可取精(jing)密度中的圖作為2h或4h，甚至6h。

做7至8個(ge)時間(jian)點(dian)，在撰寫申報資料(liao)時最后(hou)以6個(ge)數據填報。

溶液穩定性數據至(zhi)(zhi)少做到16h穩定（盡量做得更長時(shi)間，都是(shi)自(zi)動進樣，一(yi)個過夜(ye)就(jiu)至(zhi)(zhi)少在(zai)12小(xiao)時(shi)以(yi)上，時(shi)間太短無法(fa)證(zheng)明溶液穩定性），極特(te)殊情況下可以(yi)采用低(di)溫進樣器(qi)或(huo)特(te)殊的保存(cun)方(fang)法(fa)或(huo)現配現分(fen)析(xi)等(deng)操作，但要求有數據作為支持依據，方(fang)可將(jiang)特(te)殊處理方(fang)法(fa)定入標準。

6個數(shu)據計算峰面積RSD<2%。

重復性

同(tong)一批(pi)號(hao)樣品(pin)，同(tong)一人員同(tong)法(fa)操作分別稱(cheng)取2份(fen)對照品(pin)及6份(fen)供試品(pin)（樣品(pin)）溶液(ye)，各(ge)進1次。

計算含量RSD<2%，資料中體現9張圖（1張空白，2張對照，6張樣(yang)品）。

進資料的(de)圖(tu)譜必須采(cai)用生產線驗證的(de)第1批樣品進行。

中間(jian)精(jing)密度

同(tong)(tong)一批(pi)號樣品，不同(tong)(tong)人員，不同(tong)(tong)設備，同(tong)(tong)法操作，分別(bie)稱(cheng)取(qu)2份(fen)對照(zhao)品及(ji)6份(fen)供試(shi)品（樣品）溶液，各(ge)進1次。推薦次日操作，避免(mian)產生(sheng)壓(ya)針的(de)疑問(wen)（萬一審評老(lao)師沒(mei)有注意(yi)到設備編號，所以別(bie)自找(zhao)麻煩，推薦次日操作）。對照(zhao)品也要重新稱(cheng)取(qu)。

與(yu)重復性的6個數(shu)據(ju)，共同參與(yu)統計(ji)，計(ji)算12個含量(liang)數(shu)據(ju)結(jie)果，RSD<2%，資料中體現18張(zhang)圖，其中重復性9張(zhang)，次日數(shu)據(ju)9張(zhang)（1張(zhang)空(kong)白，2張(zhang)對照，6張(zhang)樣品(pin)）。進(jin)資料的圖譜必須采(cai)用生產線驗證的第1批樣品(pin)進(jin)行。

準(zhun)確度(du)

采用回收(shou)率(lv)試(shi)驗方式進(jin)行(xing)，通常采用直接(jie)回收(shou)率(lv)實(shi)驗法(fa)，按照80%、100%、120%比例分別稱(cheng)取樣(yang)品，同法(fa)操作(zuo)，每個比例各(ge)3份樣(yang)品，各(ge)進(jin)1次。

以中間(jian)精密度的含(han)量(liang)(liang)均(jun)值作(zuo)為理論(lun)含(han)量(liang)(liang)，計算(suan)回收(shou)率，回收(shou)率變動范(fan)圍98%—102%，回收(shou)率RSD<2%，資(zi)料中體現(xian)12張(zhang)(zhang)圖（1張(zhang)(zhang)空白，2張(zhang)(zhang)對照(zhao)，9張(zhang)(zhang)樣品(pin)）。進資(zi)料的圖譜必須采(cai)用(yong)生產線驗證的第1批樣品(pin)進行。

原料藥(yao)采用直接回收率(lv)。

制劑采用加樣回收率測定：

采用20片或粒制劑單位終產品混合研碎后，按比例稱取進行加樣回收，加(jia)樣回(hui)收(shou)(shou)率采(cai)用80%、100%、120%比(bi)例，1:1加(jia)入，加(jia)樣回(hui)收(shou)(shou)率不(bu)能達標時(shi)（輔料有吸附或干擾較大時(shi)），方可采(cai)用直接回(hui)收(shou)(shou)率。回收(shou)率變動范圍(wei)98%—102%，回收(shou)率RSD<2%，資料中體現(xian)12張(zhang)圖（1張(zhang)空白，2張(zhang)對照，9張(zhang)樣品）。

耐用性實驗

改變(bian)色(se)譜(pu)柱(zhu)

不同(tong)品牌的色(se)譜柱，共3個品牌。比較分離(li)度，保(bao)留時間，含量測定結果。

如果品牌(pai)(pai)不(bu)足3個可采用(yong)多個批(pi)號或不(bu)同品牌(pai)(pai)多個批(pi)號的(de)方式，不(bu)能采用(yong)廢柱子進行實驗。

最好在同(tong)一天(tian)對倆份樣品溶(rong)液(ye)(ye)和倆份對照溶(rong)液(ye)(ye)進行(xing)。

3個(ge)(ge)品牌的(de)色(se)譜柱(zhu)共15張圖(tu)（每個(ge)(ge)色(se)譜柱(zhu)1張空白，2張對照，2個(ge)(ge)樣(yang)品各(ge)1張），各(ge)條件(jian)下的(de)含量數據（n=6）的(de)RSD<2%。進(jin)資料的(de)圖(tu)譜必須采用生產(chan)線驗證的(de)第1批樣(yang)品進(jin)行。

流動相比例(li)

流動相(xiang)的低組分比例變化(hua)約±5%。

最好在同(tong)一天對倆份樣品(pin)溶(rong)液(ye)和倆份對照溶(rong)液(ye)進行。

3個不(bu)同比例的(de)(de)(de)流(liu)動(dong)相15張(zhang)(zhang)圖(tu)（每個比例1張(zhang)(zhang)空白，2張(zhang)(zhang)對照，2個樣品各1張(zhang)(zhang)），各條(tiao)件下的(de)(de)(de)含量數據（n=6）的(de)(de)(de)RSD<2%。進資料的(de)(de)(de)圖(tu)譜(pu)必須采用生產線(xian)驗證的(de)(de)(de)第(di)1批樣品進行。最優標準條(tiao)件的(de)(de)(de)圖(tu)譜(pu)每天(tian)都要重做，為了(le)避免(mian)色譜(pu)柱效(xiao)能(neng)下降(jiang)或(huo)引起(qi)其他問(wen)題無法確認。

流速變化

流速±10%。

最好在同一天對倆(lia)份(fen)樣(yang)品溶(rong)液和倆(lia)份(fen)對照溶(rong)液進(jin)行。

3個不同流(liu)速的流(liu)動(dong)相15張(zhang)(zhang)圖(tu)（每個比例1張(zhang)(zhang)空白，2張(zhang)(zhang)對(dui)照，2個樣品(pin)各(ge)1張(zhang)(zhang)），各(ge)條件下(xia)的含量數據(ju)（n=6）的RSD<2%。進(jin)資(zi)料的圖(tu)譜必(bi)須采用(yong)生產(chan)線(xian)驗證的第1批(pi)樣品(pin)進(jin)行。最優標準(zhun)條件的圖(tu)譜每天都要重做，為了(le)避免色(se)譜柱(zhu)效(xiao)能下(xia)降或引(yin)起其他問題(ti)無法確認。

不同pH

pH值±0.2

最好在同一天對倆份樣品(pin)溶液(ye)和兩份對照溶液(ye)進行。

3個(ge)不同pH的(de)(de)流動(dong)相15張(zhang)(zhang)圖（每個(ge)比例1張(zhang)(zhang)空白，2張(zhang)(zhang)對照，2個(ge)樣品(pin)各(ge)1張(zhang)(zhang)），各(ge)條件下的(de)(de)含量數據（n=6）的(de)(de)RSD<2%。進資(zi)料的(de)(de)圖譜必(bi)須采用生產線驗證的(de)(de)第1批樣品(pin)進行。最優標準條件的(de)(de)圖譜每天(tian)都要(yao)重做，為了避(bi)免(mian)色(se)譜柱效能下降或引(yin)起其他問題無法確(que)認。

柱溫

柱溫±5℃

25℃、30℃（或最優參數）、35℃

最好在同一天對倆份樣品溶液(ye)和一份對照溶液(ye)進行。

3個(ge)不(bu)同(tong)溫度(du)15張圖（每個(ge)比例1張空白，2張對照，2個(ge)樣(yang)品各1張），各條件下(xia)的含量數(shu)據（n=6）的RSD<2%。進(jin)資料的圖譜必須采用生產線驗證的第1批樣(yang)品進(jin)行。最優標準(zhun)條件的圖譜每天都要重做，為了避(bi)免色譜柱效能(neng)下(xia)降或引起(qi)其他(ta)問(wen)題無(wu)法確認。

0天樣(yang)品檢(jian)測

 方法學研究結束且各項(xiang)考察數(shu)據符(fu)合要求后，對(dui)3批生產線驗(yan)(yan)證(zheng)樣(yang)品(pin)及被仿品(pin)在同一天進行檢(jian)測。此(ci)數(shu)據在申報資料產品(pin)檢(jian)驗(yan)(yan)報告單中體現，且可作為穩定(ding)性的0天數(shu)據。

雙(shuang)樣雙(shuang)針。對照品也為雙(shuang)樣雙(shuang)針。