中(zhong)藥(yao)中(zhong)吡咯里西(xi)啶生物堿QE高分辨質譜檢測(ce)方法(fa)（EP） 

摘要：本文(wen)基于(yu)中(zhong)藥中(zhong)吡咯里(li)(li)西啶生(sheng)物(wu)堿QE質譜檢測(ce)方(fang)法（EP）的(de)快(kuai)(kuai)速(su)篩(shai)(shai)查(cha)和定(ding)量分(fen)析(xi)(xi)方(fang)法。在兩種產地中(zhong)藥（千(qian)(qian)里(li)(li)光）中(zhong)均(jun)檢測(ce)到(dao)千(qian)(qian)里(li)(li)光寧(ning)。在 15min 內，可以完(wan)成(cheng)9種化(hua)合(he)物(wu)（歐天芥(jie)菜(cai)堿 N-氧(yang)化(hua)物(wu)、歐天芥(jie)菜(cai)堿、毛(mao)果(guo)天芥(jie)菜(cai)堿、野(ye)百合(he)堿、千(qian)(qian)里(li)(li)光寧(ning)氧(yang)化(hua)物(wu)、克氏千(qian)(qian)里(li)(li)光堿、芥(jie)菜(cai)甙N-氧(yang)化(hua)物(wu)、千(qian)(qian)里(li)(li)光寧(ning)、千(qian)(qian)里(li)(li)光非靈）的(de)定(ding)性分(fen)析(xi)(xi)及(ji)定(ding)量分(fen)析(xi)(xi)。檢出(chu) 限為1.6ng/g，定(ding)量限為 5ng/g，標準(zhun)樣(yang)品(pin) 6 次(ci)平行測(ce)定(ding)的(de)相對標準(zhun)偏差低于(yu) 13.8%，精密度 較好。該方(fang)法快(kuai)(kuai)速(su)、重現性好、靈敏(min)度高，適用于(yu)中(zhong)草藥和中(zhong)成(cheng)藥中(zhong)吡咯里(li)(li)西啶類生(sheng)物(wu)堿的(de)快(kuai)(kuai)速(su)篩(shai)(shai)查(cha)和定(ding)量分(fen)析(xi)(xi)。

關鍵詞(ci)：吡咯里(li)西啶 生物堿 QE-exactive質譜 千(qian)里(li)光(guang) 快速篩查 定量分析(xi)

世界上約(yue)(yue)有 3%的有花植(zhi)物(wu)含有 PAs,主要分布于紫草科、菊科及(ji)豆科等 。目(mu)前已從(cong)近 6000種(zhong)植(zhi)物(wu)中分離得到約(yue)(yue) 660個PAs 。這些植(zhi)物(wu)中有許多(duo)是常見的雜草，會污染用(yong)于生產(chan)醫藥產(chan)品的植(zhi)物(wu)原料。

PA對植(zhi)物(wu)來(lai)說(shuo)具有(you)化學(xue)防衛的(de)功(gong)能(neng)，在一定程(cheng)度(du)上可抵御草食(shi)動物(wu)、昆蟲和植(zhi)物(wu)病原的(de)侵害。家畜采食(shi)后會導致(zhi)中毒，并在動物(wu)產品(pin)如奶、峰蜜和肝臟等中有(you)殘(can)留，有(you)致(zhi)癌(ai)、致(zhi)突變和致(zhi)畸胎的(de)毒性。PA通過傳統草藥、茶劑、谷物(wu)、功(gong)能(neng)性食(shi)品(pin)或(huo)奶制(zhi)品(pin)、肉類等食(shi)物(wu)鏈的(de)傳遞被人類攝食(shi)。

PAs的(de)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)主(zhu)要表(biao)現為(wei)(wei)急性(xing)(xing)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)、慢性(xing)(xing)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)、基因毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)和特殊毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)等 4種類型。主(zhu)要表(biao)現為(wei)(wei)肝(gan)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing) ,有的(de)還對(dui)肺(fei)、心、腎(shen)、胰(yi)、腦(nao)等具(ju)毒(du)(du)(du)性(xing)(xing)及明顯的(de)致(zhi)癌(ai)、致(zhi)突變、致(zhi)畸胎作用。

吡咯(ge)里(li)西啶類(lei)生(sheng)物堿(jian)（PAs）是(shi)一(yi)(yi)類(lei)分(fen)布廣泛的(de)(de)植物毒(du)素，大部分(fen)具(ju)有(you)(you)肝毒(du)性。隨著人們對 PAs 毒(du)性認識的(de)(de)不斷深入(ru)(ru)，規(gui)(gui)定(ding)(ding)的(de)(de) PAs 攝(she)入(ru)(ru)量(liang)也(ye)越來(lai)越嚴格。2001 年，歐洲食(shi)品(pin)安全管理局提出食(shi)品(pin)中(zhong)(zhong) PAs 的(de)(de)每日(ri)攝(she)取(qu)量(liang)應(ying)低于(yu) 70μg/kg；而(er) 2014 年，歐洲藥(yao)品(pin)管理局要求所有(you)(you)來(lai)源(yuan)的(de)(de)短期(qi)口(kou)服藥(yao)中(zhong)(zhong)的(de)(de) PAs 的(de)(de)日(ri)攝(she)入(ru)(ru)限值(zhi)為0.005μg/kg（按平均體重 65kg）。千里(li)光作(zuo)為一(yi)(yi)種(zhong)常見的(de)(de)中(zhong)(zhong)草藥(yao)，含有(you)(you)較多(duo)的(de)(de)阿多(duo)尼(ni)(ni)弗林(lin)堿(jian)（adonifoline）。中(zhong)(zhong)國藥(yao)典（2015 版）規(gui)(gui)定(ding)(ding)千里(li)光中(zhong)(zhong)的(de)(de)阿多(duo)尼(ni)(ni)弗林(lin)堿(jian)含量(liang)應(ying)低于(yu) 0.004%（40μg/g），其他(ta)吡咯(ge)里(li)西啶生(sheng)物堿(jian)未做(zuo)規(gui)(gui)定(ding)(ding)。PAs 廣泛存在(zai)于(yu)草藥(yao)、茶葉、谷物中(zhong)(zhong)，可以(yi)通過食(shi)物鏈傳遞(di)。因(yin)此，迫(po)切(qie)需要開發一(yi)(yi)種(zhong)快速篩查方法來(lai)有(you)(you)效(xiao)地監測其含量(liang)。

目前，主要通過 LC-MS/MS和(he)LC-QTOF對PAs進行鑒定和(he)分析。前處理(li)和(he)色(se)譜分析需要較長的時間。

本應用(yong)基于(yu)歐洲藥典(dian)EP2.8.26項下方(fang)法(fa)(fa)建(jian)立了(le)千(qian)里光中(zhong)吡(bi)咯里西啶類(lei)生(sheng)物(wu)堿的快速篩查和(he)定(ding)量分析(xi)方(fang)法(fa)(fa)。通過中(zhong)國藥典(dian)一部千(qian)里光項下方(fang)法(fa)(fa)和(he)白背(bei)三七中(zhong)吡(bi)咯里西啶生(sheng)物(wu)堿的含(han)量分析(xi)及風險評價文獻中(zhong)方(fang)法(fa)(fa)對該(gai)方(fang)法(fa)(fa)的結果進行了(le)對比(bi)。該(gai)方(fang)法(fa)(fa)簡便、靈敏、準確(que)，適(shi)用(yong)于(yu)中(zhong)草(cao)藥和(he)中(zhong)成藥中(zhong)吡(bi)咯里西啶類(lei)生(sheng)物(wu)堿的快速篩查和(he)定(ding)量分析(xi)。

實驗部(bu)分

1.1儀器

本實驗使用賽默飛公司的QE-exactive高分辨質譜。具體配置為：離子源（ESI），Xcalibur3.1 工作站。

1.2樣品制備(bei)

樣品經超聲提取、離心和稀釋后，直接進行分析。

具(ju)體步(bu)驟如下：

1. 準確稱取2.0g樣品(pin)于50 mL 離心(xin)管；

2. 加入20.0ml0.28%硫酸水(shui)溶液(ye)，完全浸濕，超(chao)聲提取15min；

3. 混合溶液在(zai)3800r/min離心10min，取上清液，重復提取一次(ci)；

4. 合并上清液，用(yong)20%氨(an)水(shui)中和至PH為7；

5. 先(xian)用(yong)5ml甲醇沖洗(xi)(xi)SPE C18固相(xiang)萃(cui)取柱(zhu)后(hou)，再用(yong)5ml水沖洗(xi)(xi)SPE C18固相(xiang)萃(cui)取柱(zhu)，樣品上清液全(quan)部過SPE C18固相(xiang)萃(cui)取柱(zhu)后(hou)，用(yong)5ml甲醇洗(xi)(xi)脫，收集洗(xi)(xi)脫液，置于50℃溫度下氮(dan)氣吹(chui)干；

6. 用1.0ml5%甲(jia)醇水復溶，過(guo)0.22um有機(ji)膜；

7. 取(qu)5ul復溶液進樣分析。

1.3分析條件

液(ye)相條件：

流動(dong)相A：5mmol甲(jia)酸銨水溶液（0.1%甲(jia)酸）

流動性B：5mmol甲酸銨甲醇溶液（0.1%甲酸）

色譜(pu)柱：CAPCELL PAK ADME 3um 2.1mm×150mm

柱溫：40℃  樣品(pin)盤溫度：20℃    進樣量：5ul

洗針液：80%甲醇水（0.1%）

表1梯(ti)度

質譜部分(fen)：

離子源：ESI+               Resolution：70000

Scan type：Full MS         Scan range：100-500m/z

AGC target:2e5             Microscans:3

Maximum inject time:200    Aux gas flow rate:15

Sheath gas flow rate:50    Spray voltage(KV):3.5

Capillary temp(℃):270     Heater temp(℃):300

S-lens RF level:60    ;    

表2千里光藥材(cai)的PAs檢出種(zhong)類（提(ti)取離(li)子公(gong)差為5ppm）

結果(guo)與(yu)討論

2.1專屬性色(se)譜(pu)圖

圖1專屬性色譜圖及質(zhi)譜圖-安國(guo)產地(di)（對照(zhao)濃度10ug/ml）

圖2專屬性(xing)色譜(pu)圖及質譜(pu)圖-亳州產地（對照濃(nong)度10ug/ml）

按照 1.3 節(jie)的分(fen)析條件分(fen)析了千里光寧吡咯里西啶生物(wu)堿。溶劑空白、基質空白對本方法無影(ying)響，專屬性良好。安國產(chan)地千里光藥材檢出(chu)千里光寧的含(han)(han)量為4.84ug/g；亳州產(chan)地千里光藥材檢出(chu)千里光寧的含(han)(han)量為310.7ng/g。

2.2重復性(xing)色譜圖

圖(tu)3重復性色譜圖(tu)（濃度(du)10ug/ml）

按(an)照(zhao) 1.3 節的(de)分(fen)析(xi)條件(jian)分(fen)析(xi)了千(qian)里光寧(ning)吡咯里西啶生物堿(jian)，在(zai)10ug/ml濃(nong)度時，6次測量的(de) RSD低于10%。結果表(biao)明本方法重復性(xing)良好。

2.3實測樣本與中(zhong)國藥(yao)典一部千里(li)光項下方(fang)法和(he)白背三七(qi)中(zhong)吡咯(ge)里(li)西啶生物堿的含量分析及(ji)風(feng)險評價文獻中(zhong)方(fang)法進行比較

表3三種方(fang)法的檢測(ce)結果對(dui)比

本方法(fa)檢出能力(li)比中國(guo)藥(yao)(yao)典(dian)和國(guo)內文獻都高，歐洲(zhou)藥(yao)(yao)典(dian)方法(fa)吡咯里西啶(ding)生物(wu)堿檢測(ce)種類(lei)達(da)到了28種。

結論

基于QE-exactive高(gao)分辨質譜(pu)，建立了一種(zhong)測定中草藥中吡咯(ge)里西(xi)啶(ding)類(lei)生物(wu)(wu)堿(jian)的 快速篩(shai)查和定量分(fen)析方法。結(jie)果表明，該方法能滿足日常(chang)分(fen)析的要求。該方法具(ju)有分(fen)析時間短、精(jing)度高(gao)、靈敏度和選擇性高(gao)等優點。因此，適用于中草藥和專(zhuan)利藥中吡咯(ge)里西(xi)啶(ding)類(lei)生物(wu)(wu)堿(jian)的快速篩(shai)查和定量分(fen)析。